一、产品简介：

本试剂盒提供一种快速、灵敏的检测方法：D-乳酸在D-乳酸脱氢酶的作用下生成丙酮酸，并使NAD+还原生成NADH；为了使该反应顺利进行另添加酶进一歩分解丙酮酸；生成NADH 与特异显色剂反应产生在450nm 处有最大吸收峰的有色物质，通过检测该物质在450nm 的增加量，进而计算出D-乳酸含量。

二、试剂盒组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、研钵、离心机。

四、D-乳酸（D-LA）含量测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：0.1g 组织样本，加1mL 的提取液研磨，粗提液全部转移到EP 管中，

12000rpm，离心10min，上清液待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；于4℃，12000g 离心10min，取上清测定。

【注】：若增加样本量，可按细菌/细胞数量（104 个）：提取液（mL）为1000~5000：1 的比例进行提取。

③ 液体样品：a.近似中性的液体样品可直接取1mL 转移到EP 管中；12000rpm，离心10min，上清液待测。

b.酸性液体样本，则需先用KOH（5M）调溶液的PH 值至约8，并在室温下孵育30 分钟。取1mL 转移到EP 管中；12000rpm，离心10min，上清液待测。

④ 血清样本：澄清的血清样本可以直接检测。

2、上机检测：

① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

② 临用前试剂一、二、三、四可按照比例 40:20:540:20 混成混合液（用多少配多少量），下歩加样表中直接加620μL 混合液。

③ 所有试剂解冻至室温（25℃）或在水浴锅（25℃）中孵育10min，在1mL 玻璃比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】1. 若样本自身有很强的背景值（如颜色很深或含有还原性物质如抗坏血酸等），可以加设一个样本自身对照：即试剂五用蒸馏水替代，其他试剂保持不变，则△A=A 测定-A 对照。

2. 若△A 值较小，可增加样本上样量V1（如增至100μL，则试剂三相应减少），则改变后的V1

需代入计算公式重新计算。

3. 若△A 值较大，或A 测定超过了标曲最高点，可对样本用蒸馏水稀释；或减少样本上样量V1

（如减至20μL，则试剂三相应增加），则稀释倍数D 和改变后的V1 需代入公式重新计算。

五、结果计算：

2、按照样本质量计算：

D-乳酸(µmol/g 鲜重)=[(△A+0.0101)÷39.127]÷(W×V1÷V)×D=0.43×(△A+0.0101)÷W×D

3、按照细菌/细胞计算：

D-乳酸(µmol/104 cell)=[(△A+0.0101)÷39.127]÷(500×V1÷V)×D=0.0009×(△A+0.0101)×D

4、按照液体体积计算：

D-乳酸(µmol/mL)=[(△A+0.0101)÷39.127]÷V1×D =0.43×(△A+0.0101)×D

5、按照血清体积计算：

D-乳酸(µmol/mL)=[(△A+0.0101)÷39.127]÷V1×D =0.43×(△A+0.0101)×D

V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入反应体系中样本体积，0.06mL；W---样本质量，g； D-乳酸分子量 Mr---90.08；

500---细胞数目，万； D---稀释倍数，未稀释即为 1。附：标准曲线制作过程：

1 制备标准品母液（30μmol/mL）：临用前取 1mL 蒸馏水至 2mLEP 管中，再向 1mL

蒸馏水中加入3μL 的标准品，混匀，即得标准品母液浓度为30μmol/mL。

2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.06, 0.12, 0.18, 0.24, 0.3. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3 依据测定管加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。