一、产品简介：

ATP-柠檬酸裂解酶（ACL，EC 4.1.3.8）是糖代谢和脂肪酸生物合成的关键酶，其作用底物和产物是糖代谢中的关键中间产物，并可作为脂肪酸合成的底物；同时在植物的生长发育以及提高植物抗逆性方面发挥了重要作用。此外，ACL也是三羧酸循环的关键酶。

ACL在ATP和辅酶A存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH生成苹果酸和NAD+，在340nm测定NADH减少速率，即可得到ACL酶活性大小。

二、试剂盒组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

四、ATP-柠檬酸裂解酶（ACL）活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约 0.1g 组织（水分充足的果实样本可取 0.5g），加 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，

12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：也可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为1000~5000：1 的比例进行提取

③ 液体样品：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至340nm，温度可以设定为25℃。

② 刚从低温下拿出的试剂二和三在可在 25℃水浴锅中孵育10min。

③ 在 96 孔板中依次加入：

1. 若ΔA 差值在零附近徘徊，可以延长反应时间10min 到30min，则相应的反应时间T 则代入计算公式重新计算；或者加大样本上样量（如：由10μL 增加到20μL，则试剂三相应减少，保持总体积200μL 不变），改变后的加样体积即V1 代入计算公式重新计算；或者由0.1g

样本取样量增加到0.2g，加1mL 的提取液研磨提取，则改变后的取样W 需代入公式计算。

2. 若下降趋势不稳定，可以每隔10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

3. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。

或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测。

五、结果计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算

酶活定义：每克组织每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W

3、按细菌/细胞密度计算：

酶活定义：每1 万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA

4、按液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T=643.1×ΔA

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； V：加入提取液体积，1 mL；

V1---加入样本体积，0.01 mL； V2---反应体系总体积，2×10-4 L；

T---反应时间，10min； d---96 孔板光径，0.5cm；

500---细菌或细胞总数，500 万； W---样本质量，g；

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。