一、产品简介：

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)属于裂解酶家族，分为两种类型：一类是ATP 依赖性即ATP－PEPCK（EC 4.1.1.49），主要存在于开花植物、藻类及部分真菌和细菌中。另一类是GTP   依赖性即GTP－PEPCK（EC 4.1.1.32），主要存在于哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫、软体动物、扁虫、线虫、眼虫及部分真菌和细菌中。

本试剂盒测定的是ATP 依赖性的PEPCK，催化草酰乙酸和ATP 生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂，接着在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶存在下依次催化NADH 氧化生成NAD+，通过于340nm 下测定NADH 的下降速率，即可反映PEPCK 酶活性大小。

二、试剂盒组分与配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

四、ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ATP-PEPCK)活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品和实验流程，避免样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔 10s，重复 30 次）； 4℃×12000rpm   离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：也可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至340nm。

② 所有试剂解冻至室温（25℃）或者于25℃水浴条件下预热15min。

③ 试剂二和三和四和五和六可按照 10:10:10:10:120 比例配成混合液（一枪加

160μL 该混合液）（该混合液用多少配多少，现配现用），在 96 孔板中依次加入：

【注】1.若△A 值小于0.01，可适当延长反应时间T 到10min 或更长读取A2。或适当加大样本量V1（如由10μL 增至20μL，则试剂六相应减少。）则改变后的T 和V1 需代入计算公式重新计算。

2. 若A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。

或向待测样本上清液中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清用于检测。

3. 若A1 值低于0.6 或△A 大于0.4，可减少反应时间（如2min 后读取A2 值），则改变后的反应时间T 代入计算公式重新计算。

4. 若下降趋势不稳定，可以每隔10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。ATP-PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=1286.2×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ATP-PEPCK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(W×V1÷V)÷T=1286.2×ΔA÷W

3、按细菌/细胞密度计算：

酶活定义：每1 万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ATP-PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(500×V1÷V)÷T=2.57×ΔA

4、按照液体计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ATP-PEPCK(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷V1÷T=1286.2×ΔA

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm；

V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.01 mL； T---反应时间，5min；V2---反应体系总体积，2×10-4 L； 500---细菌或细胞总数，万； W---样本质量，g；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。