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一、产品简介：
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)属于裂解酶家族，分为两种类型：一类是ATP 依赖性即ATP－PEPCK（EC 4.1.1.49），主要存在于开花植物、藻类及部分真菌和细菌中。另一类是GTP 依赖性即GTP－PEPCK（EC 4.1.1.32），主要存在于哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫、软体动物、扁虫、线虫、眼虫及部分真菌和细菌中。
本试剂盒测定的是ATP 依赖性的PEPCK，催化草酰乙酸和ATP 生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，接着在丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶存在下依次催化NADH 氧化生成NAD+，通过于340nm 下测定NADH 的下降速率，即可反映PEPCK 酶活性大小。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 |
粉剂mg×2 支 |
-20℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支再加 1.6mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 |
试剂二 |
粉剂mg×2 支 |
4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支加 1.2mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂三 |
粉剂mg×2 支 |
-20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，每支再加 0.6mL 蒸馏水充分溶解备用，可分装冻存，禁止反复冻融。 |
试剂四 |
粉剂mg×2 支 |
-20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，每支再加 0.6mL 蒸馏水充分溶解备用，可分装冻存，禁止反复冻融。 |
试剂五 |
粉剂mg×5 支 |
4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，每支再加 0.25mL 蒸馏水充分溶解备用，避光保存，两天内用完（试剂变色即舍弃）。 |
试剂六 | 液体35mL×1 瓶 | 4℃保存 |
三、所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ATP-PEPCK)活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品和实验流程，避免样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔 10s，重复 30 次）； 4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：也可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃）或者于25℃水浴条件下预热15min。
③ 试剂二和三和四和五和六可按照 40:20:20:20:600 比例配成混合液（一枪加700μL 该混
合液）（该混合液用多少配多少，现配现用），在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 40 |
试剂一 | 60 |
试剂二 | 40 |
试剂三 | 20 |
试剂四 | 20 |
试剂五 | 20 |
试剂六 | 600 |
混匀，30℃条件下，立即于340nm 处读取吸光 值A1，5min 后读取A2 值，△A=A1-A2。 | |
【注】1. 若△A 小于0.01，可适当延长反应时间T 到10min 或更长读取A2。或适当加大样本量V1（如由40μL 增至60μL，则试剂六相应减少。）则改变后的T 和V1 需代入公式重新计算。
2. 若A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。
或向待测样本上清液中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；
3. 若A1 值低于0.6 或△A 大于0.4，可减少反应时间时间（如2min），则改变后的反应时间T 代入计算公式重新计算。
4. 若下降趋势不稳定，可以每隔10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。ATP-PEPCK(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W
3、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：每1 万个细胞每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA
4、按照液体计算：
酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×109×V2]÷V1÷T=643.1×ΔA
ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d---光径，1cm；
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04mL； T---反应时间，5min；V2---反应体系总体积，8×10-4 L； 500---细菌或细胞总数，万； W---样本质量，g；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
