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一、产品简介：
Ca2+是细胞内重要的信号分子，细胞质基质始终维持在一个较低水平的Ca2+浓度，Ca2+ 浓度的维持主要由Ca2+-ATP 酶来维持，该酶可催化ATP 水解生成ADP 和无机磷。通过测定无机磷的量来确定该酶活性高低。
二、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
三、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 8mL 提取液，混匀溶解备用。 |
试剂二 | 粉体×1 瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 15mL 提取液，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体4mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | A:粉体mg×1 瓶 B:液体3mL×1 瓶 | 4℃保存 | 临用前试剂A 中加2.9mL 的B 液，再 加37.1mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
标准品 | 粉体mg×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
四、Ca2+-ATP 酶活性检测：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500 万细菌或细胞加入1mL
提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；
12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104)：提取液(mL)为500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至700nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃）。
③ 在 EP 管中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 200 |
提取液 | 200 | |
样本 | 200 | |
试剂二 | 200 | 200 |
37℃ 孵育20min | ||
试剂三 | 80 | 80 |
样本 | 200 | |
混匀，12000rpm，4℃离心5min，上清液待测 | ||
④ 显色反应：
上清液 | 150 | 150 |
试剂四 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min，700nm 下读取各管吸光值， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 | ||
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y =0.8474x - 0.0164，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白分解ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。酶活力(μmol/h/mg prot)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T
=12.04×(△A+0.0164)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织分解ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。酶活力(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W× V1÷V)÷T
=12.04×(△A+0.0164)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1 万个细菌或细胞分解ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。酶活力(μmol/h /104 cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(500×V1÷V)÷T
=0.024×(△A+0.0164)
5、液体中Ca2+-ATPase 活力计算：
定义：每小时每毫升液体分解ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷V1÷T=12.04×(△A+0.0164)
V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.2mL ；
V2---酶促反应总体积，0.68mL； T---反应时间，1/3 小时；
W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，万；
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用1mL 提取液溶解。（母液需在两天内用）。
2 把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
