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一、产品简介：
三磷酸腺苷（ATP）是生物体内能量转换最基本的载体,是生物体内最直接的能量来源，测定ATP 含量并且计算能荷，能够反映能量代谢状态。
肌酸激酶催化三磷酸腺苷（ATP）和肌酸生成磷酸肌酸，用磷钼酸比色法进行检测，经波长扫描产物在700nm 处有最大吸收峰，进而计算得到ATP 的含量。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液A 50mL×1 瓶 提取液B 10mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 |
粉剂mg×2 支 |
-20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉体落入底部，每支再加入 1.1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 |
试剂二 | 液体10mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 |
粉剂μg×2 支 |
-20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉体落入底部，每支再加入 0.55mL 蒸馏水溶解待用；用不完的试剂分装后 -20℃保存，禁止反复冻融。 |
试剂四 |
粉剂mg×2 瓶 |
4℃保存 | 临用甩几下使粉剂落入底部，每瓶再依次加入 2.86mL 水混匀，最后加1.14mL 浓硫酸（加浓硫酸时务必小心，逐滴缓慢加入水中，注意防护）。 |
试剂五 | 液体40mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
标准液 |
粉体mg×1 支 |
-20℃保存 | 用前准确称取2mg 粉体即ATP 至一新EP 管中，再加1.7mL 蒸馏水溶解即2μmoL/mL，再用水稀释一倍成1μmoL/mL 标准品，待用(-20℃保存，一 周内用完)。 |
【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、水浴锅、浓硫酸、可调式移液枪、研钵和蒸馏水。
四、ATP 含量检测：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约0.1g 组织加入研钵中，加0.5mL 提取液A 进行匀浆，转至EP 管中，于12000rpm，室温离心10min，取出250μL 上清液至一新EP 管中，再加入适量提取液B 调PH 至中性（用PH 试纸测量，PH 在6.5-8 之间均可）。再加蒸馏水定容至0.5mL，该液体待测备用。
【注】：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
② 细菌/真菌样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心弃上清；取500 万细菌或细胞至研钵中，加0.5mL
提取液A 进行匀浆，低温超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔
10s，重复30 次），于12000rpm，室温离心10min，取出250μL 上清液至一新EP 管中，再加入适量提取液B 调PH 至中性（用PH 试纸测量，PH 在6.5-8 之间均可）。再加蒸馏水定容至0.5mL，该液体待测备用。
③ 液体样本：
澄清样本直接检测，若浑浊则12000rpm，4℃离心 5min 后取上清液测定。
【注】：也可以按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到700nm。
② 反应液配制：按照试剂四：试剂五=1：5 的比例混匀。用多少配多少的混合液。
③ 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 （仅做一次） | 空白管 （仅做一次） |
样本 | 20 | 20 | ||
标准液 | 20 | |||
试剂一 | 20 | 20 | ||
试剂二 | 50 | 50 | 50 | 50 |
试剂三 | 10 | 10 | ||
蒸馏水 | 30 | 50 | ||
充分混匀，37℃准确水浴 30min | ||||
反应液 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀，37℃水浴 20min，液体全部转移至96 孔板中，在700nm 下 读取各管吸光值A（每个测定管需设一个对照管）。 | ||||
【注】若A 测定-A 对照的值小于0.01，可增加取样质量W（如增至0.2g）或增加样本加
样量V1（如由20μL 增至50μL，则试剂二相应减少）；标准管仍为20μL，其他试剂不变；则改变后的W 和V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本鲜重计算：
ATP 含量(μmol/g 鲜重)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(W×V1÷V)
=(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)÷W 2、按细菌/细胞密度计算：
ATP 含量(nmol/104 cell)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷(500×V1÷V)×103
=2×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白) 3、液体中ATP 含量计算：
ATP 含量(μmol/mL)=[C 标准×V 标×(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)]÷V1
=(A 测定-A 对照)÷(A 标准-A 空白)
C 标准---标准液浓度，1μmol/mL； V---加入提取液体积，1mL；
V1---加入反应体系中样本体积，0.02mL； V 标---标准品加样体积，0.02mL；
W---样本质量，g； 500---细胞或细菌总数，万。
