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一、产品简介：
谷氨酸合成酶（GOGAT)广泛分布于植物中，植物吸收的无机氮经硝酸还原酶（NR）和亚硝酸还原酶（NIR）还原成NH4+后，通过谷氨酰胺合成酶（GS）参与的GS/GOGAT 途径才能进行氮素的同化和利用。GOGAT 一般包含两类：一类是多存在于叶绿体（叶片）中的Fd-GOGAT，另一类是多存在于非绿色组织（根）前质体中的NADH-GOGAT。
Fd-谷氨酸合成酶（Fd-GOGAT, EC 1.4.7.1) 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸；再用特异于谷氨酸的酶复合体分解谷氨酸，同时与显色剂反应生成黄色物质，该物质在450nm 处有最大吸收峰，进而得到Fd-谷氨酸合成酶的酶活性大小。
该酶催化反应：L-glutamine+2-oxoglutarate+2reduced ferredoxin+2H+ = 2L-glutamate+2 oxidized ferredoxin。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体110mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部， 再加12mL 的提取液充分溶解，仍4℃保存。 |
试剂二 | 粉剂mg×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部， 再加12mL 的提取液充分溶解，仍4℃保存。 |
试剂三 | 粉剂mg×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部， 再加12mL 的提取液充分溶解，仍4℃保存。 |
试剂四 | 试剂四A mg×3 支试剂四B mg×3 支 |
4℃保存 | 临用前一支试剂A 和B 分别用1.5mL 蒸馏水完全溶解，再把1.5mL 试剂B 倒入1.5mL 试剂A 中混成试剂四(一周内用完)。 |
试剂五 | 液体9mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 |
粉剂mg×1 支 |
-20℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部， 再加3.5mL 蒸馏水溶解，可分装后于-20℃保存（尽量避免反复冻融）。 |
试剂七 | 液体2mL×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下或4℃离心使试剂落入试管底部， 避免试剂浪费。 |
标准品 | 液体mL×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、可调式移液器、研钵和蒸馏水。
四、Fd-GOGAT 酶活性检测：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织（水分多的样本取0.5g），加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】:若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1:5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；
超声波破碎细菌或细胞（冰浴，300W，超声3s，间隔7s，总时间3min）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】:若增加样本量，按照细菌/细胞数量(104 个)：提取液体积(mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃），或可放在25℃条件下水浴5-15min。
③ 第③步的显色反应：试剂五和六和七可按照 70:30:20 比例配成混合液（一枪加120μL 该混合液，最后加上清液）（该混合液用多少配多少，现配现用）。
④ 在 EP 管中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 100 | 100 |
试剂二 | 100 | 100 |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀，30℃孵育5 分钟 | ||
样本 | 200 | 200 |
蒸馏水 | 100 | |
试剂四 | 100 | |
混匀，30℃反应30min（准确时间）后，立即于95℃沸水中水浴5 分钟，室温放置10min 后至室温（务必使温度降至室温或流水加速冷却至室温），至室温后务必于漩涡震荡仪上剧烈振荡5min，再于 12000rpm 离心5min，上清液待测。 | ||
③ 显色反应：在 EP 管中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
提取液 | 230 | 230 |
试剂五 | 70 | 70 |
试剂六 | 30 | 30 |
上清液 | 350 | 350 |
试剂七 | 20 | 20 |
混匀，30℃反应 15min，液体全部转移至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm） 中，立即于450nm 处读取吸光值A，△A=A 测定-A 对照（每个样本需设一个自身对照）。 | ||
【注】1.若△A 差值在零附近徘徊，可以在显色反应阶段增加上清液（V3）的量（如增加到500μL，则提取液相应减少）；或延长第②歩中30℃反应时间T（如由30min 增加至60min），或增加取样质量W（如由0.1g 增至0.2g），则改变后的V3 和T 和W 需代入计算公式重新计算。2.若A 测定的值大于1.2，则可降低显色反应阶段增加上清液（V3）的量（如减至150μL，则
提取液相应增加或者用水补充）。则改变后的V3 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程为y = 0.0451x - 0.002；x 为标准品谷氨酸的摩尔质量（nmol），y 为△A。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克组织蛋白每小时生成1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
Fd-GOGAT(nmol Glu/h/mg prot)=[(ΔA+0.002)÷0.0451]×(V2÷V3)÷(V1×Cpr)÷T
=380.1×(ΔA+0.002)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：每克组织每小时生成1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
Fd-GOGAT(nmol Glu/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.002)÷0.0451]×(V2÷V3)÷(W×V1÷V)÷T
=380.1×(ΔA+0.002)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每百万细菌或细胞每小时生成1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。
Fd-GOGAT(nmol Glu/h/104 cell)=[(ΔA+0.002)÷0.0451]×(V2÷V3)÷(500×V1÷V)÷T
=0.76×(ΔA+0.002)
V--提取液体积，1 mL； V1--加入样本体积，0.2mL； V2--反应总体积，0.6mL；V3--显色阶段上清液体积，0.35mL； T--反应时间，30min=1/2h； W--样本质量，g；500---细胞数量，万；
Cpr--样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司BCA 蛋白含量测定试剂盒。附：标准曲线制作过程：
1 标准品母液（10nmol/μL）。
2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05. nmol/μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 依据显色反应阶段，测定管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
