一、产品简介

Caspase-3 又称CPP32、Yama 或apopain，属于CED-3 亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。

利用 Caspase-3 分解底物 Ac-DEVD-pNA 产生黄色的对硝基苯胺（pNA），后者在 405nm

有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出Caspase-3 酶活性大小。

二、试剂盒组分与配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。

四、Caspase-3 活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取

② 细菌或培养细胞：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；4℃×12000rpm   离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为500-1000：1 的比例进行提取

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至405nm。

② 所有试剂解冻至室温（25℃）或于水浴锅（25℃）中孵育10min，在96 孔板中依次加入：

【注】：1. 加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若A2 值大于1.5，可减少样本加样量V1（如减至10μL，则试剂一相应增加），或缩短反应时间T（如由1h 减至30min），则改变后的V1 和T 需代入公式重新计算。

2. 若ΔA 小于0.01，可延长反应时间T（如由1h 增至2h 或更长），则改变后T 需代入重新计算。

五、结果计算：

2、按样本鲜重计算：

单位定义：每克组织每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。

Caspase-3(nmoL/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(W×V1÷V)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每毫克组织蛋白每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。

Caspase-3 (nmoL/h/mgprot)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(V1×Cpr)÷T=859.1×(ΔA+0.0004)÷Cpr

4、按细胞数量计算：

单位定义：每 104 个细胞每小时催化底物产生 1nmoL 对硝基苯胺定义为一个酶活单位（U）。

Caspase-3 (nmoL/h/104 cell)=[(ΔA+0.0004)÷0.0291]÷(500×V1÷V)÷T=1.72×(ΔA+0.0004)

V---加入提取液体积，1 mL；V1---加入样本体积，0.04mL；T---反应时间，1h；W---样本质量，g；

500---细胞数量；D---稀释倍数，未稀释即为 1；

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：

1 制备标准品母液（50μmol/mL）：临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入0.5mL 乙醇，涡旋震荡溶解后再加入0.5mL 的蒸馏水混匀，得到50μmol/mL 备用。

2 用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。

3 40μL 标准品+160μL 试剂一，混匀后于405nm 处读取A 值，依据结果即可制作标准曲线。