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一、产品简介：
4-香豆酸：辅酶A 连接酶（4CL ，EC 6.2.1.12）是木质素生物合成的关键酶之一，位于苯丙酸途径与木质素特异合成途径的转折点上，主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶A 酯。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
4CL 催化4-香豆酸和CoA 生成4-香豆酸CoA，在333nm 下测4-香豆酸CoA 生成速率，即可反映4CL 活性。
二、试剂盒组分与配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体28mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加5mL 蒸 馏水，于80-100℃水浴1-2 分钟溶解备用。 |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加4.1mL 蒸馏水充分溶解备用。 |
三、所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、低温台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、4-香豆酸:辅酶A 连接酶（ 4CL)活性测定：
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g），加入 1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取
② 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔 10s，重复 30 次）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照数量（104）：提取液体积(mL)为500-1000：1 的比例进行提取
③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心10min，取上清液检测。
2、上机检测：
紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至333nm，蒸馏水调零。所有试剂至常温状态。在1mL 石英比色皿（光径1cm）中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 80 |
试剂一 | 560 |
试剂二 | 80 |
试剂三 | 80 |
混匀，室温（25℃）下立即于333nm 处读取吸 光值A1，30min 后再读取A2，△A=A2-A1。 | |
【注】1. 若△A 在零附近徘徊，可加大样本量（如增至160μL，则试剂一相应减少），或延长
反应时间T，则改变后的样本体积V1 和T 需代入公式重新计算。
2. 若上升趋势不稳定，可每隔2min 读取一次吸光值，选取一段线性上升时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟使吸光值变化0.005 所需的酶量定义为一个酶活力单位。
4CL(U/mg prot)=ΔA÷(V1×Cpr)÷0.005÷T=83.3×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：每克组织每分钟使吸光值变化0.005 所需的酶量定义为一个酶活力单位。
4CL(U/g 鲜重)=ΔA÷(W×V1÷V)÷0.005÷T=83.3×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
酶活定义：每1 万个细菌或细胞每分钟使吸光值变化0.005 所需酶量定义为一个酶活单位。
4CL(U/104 cell)=ΔA÷(500×V1÷V)÷0.005÷T=0.17×ΔA
4、按液体体积计算：
酶活定义：每毫升液体每分钟使吸光值变化0.005 所需的酶量定义为一个酶活单位。
4CL(U/mL)=ΔA÷V1÷0.005÷T=83.3×ΔA
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.08 mL；T---反应时间，30min； W---样本质量，g；
500---细菌或细胞总数，500 万。
Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。
