一、产品简介：

3-磷酸甘油(G3P)被3-磷酸甘油氧化酶(GPO)氧化生成过氧化氢(H₂O₂)，H₂O₂ 与4-氨基氨替吡啉等反应生成红色醌类化合物，其在510nm 处有特征吸收峰，通过检测510nm 处吸光值变化即可得出3-磷酸甘油氧化酶(GPO)活性大小。

二、试剂盒的组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

四、3-磷酸甘油氧化酶(GPO)含量测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm，4℃离心

10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取

② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞，加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；12000 rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(10 4)：提取液(mL)为500~1000：1 的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min，调节波长到510 nm。

② 所有试剂解冻至 37℃或于37℃水浴锅中水浴5-10min。

③ 在 96 孔板中依次加入：

【注】1.若ΔA 较小，可以增加反应时间T（如增至1 小时）,或增加样本量V1（由20μL 增至50μL，则试剂二相应减少），则改变后的T 和V1 需重新代入公式计算。

2.ΔA 最好控制在标准曲线的线性范围内，若ΔA 的值超过1，可对样本进行稀释再测定，稀释倍数D 代入公式计算；或减少样本量V1（如减至10μL，则试剂二相应增加），或减少反应时间T（如减至10min），则改变后的T、V1 和稀释倍数D 需重新代入公式计算。

五、结果计算：

1、标准曲线方程为y = 19.14x - 0.0145；x 为标准品摩尔质量（μmoL），y 为△A。

2、按照样本质量计算：

酶活定义：每克组织每分钟分解底物生成1nmoL 的H₂O₂ 定义为一个酶活单位(U)。

GPO 活性(nmoL/min/g   鲜重)=[(ΔA+0.0145)÷19.14×103]÷(W×V1÷V)÷T×D

=87×(ΔA+0.0145)÷W×D

2、按照样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟分解底物生成1nmoL 的H₂O₂ 定义为一个酶活单位(U)。

GPO 活性(nmoL/min/mg prot)=[(ΔA+0.0145)÷19.14×103]÷(Cpr×V1)÷T×D

=87×(ΔA+0.0145)÷Cpr×D

3、按细胞数量计算：

酶活定义：每10⁴ 个细胞每分钟分解底物生成1nmoL 的H₂O₂ 定义为一个酶活单位(U)。

GPO 活性(nmoL/min/104 cell)=[(ΔA+0.0145)÷19.14×103]÷(500×V1÷V)÷T×D

=87×(ΔA+0.0145)÷500×D

4、按液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟分解底物生成1nmoL 的H₂O₂ 定义为一个酶活单位(U)。

GPO 活性(nmoL/min/mL)=[(ΔA+0.0145)÷19.14×103]÷V1÷T×D=87×(ΔA+0.0145)×D

W---样品质量，g； V---提取液体积，1 mL；V1---上清液体积（mL），0.02mL；    T---反应时间，30 min；D---稀释倍数，未稀释即为 1； 500---细胞数量，万；

Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白质含量测定试剂盒。附：标准曲线制作过程：

1 标准品浓度：试剂盒所带标准品母液浓度为250mM。

2 把母液用蒸馏水稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2mM。也可根据实际样本来调整标准品浓度。

3 依据测定管加样体系，于510nm 处测定；根据结果即可制作标准曲线。