- 产品详情
- 产品参数
- 产品评论
一、产品简介：
3-磷酸甘油酯酶（GPP，EC3.1.3.21）催化3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油，是甘油合成过程中的最后一步酶促反应，该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。
本试剂盒采用3-磷酸甘油为底物，用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸根离子的量，进而得出3-磷酸甘油酯酶的活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体35mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 |
粉剂mg×1 瓶 |
-20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底 部，临用前加3.6mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂-20℃分装保存。 |
试剂二 | 液体3mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 |
A:粉体mg×1 瓶 B:液体3mL×1 瓶 |
4℃保存 | 临用前在试剂A 中加2.7mL 的B 液，再加34.8mL 的蒸馏水，混匀溶解备用。用不完的试剂4℃保存，若试剂 变色则舍弃。 |
标准品 | 粉体mg×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
【注】：全程操作需无磷环境；试剂配置最好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，免磷污染。
三、所需的仪器和用品：
分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径1cm）、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰。
四、α-磷酸甘油酯酶（GPP）活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
取约0.1g 组织（水分充足的样本可取0.5g）到研钵内，加入1mL 提取液，在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
[注]：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
② 细菌/真菌样本：
先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌/真菌加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
[注]：也可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例进行提取）
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至700nm，蒸馏水调零。
② 在 EP 管中依次加入下列试剂：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 60 | |
提取液 | 60 | 60 |
试剂一 | 60 | 60 |
混匀，37℃孵育30min。 | ||
试剂二 | 60 | 60 |
样本 | 60 | |
混匀，12000rpm，4℃离心5min，取上清待测。 | ||
③ 显色反应，在 EP 管中加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂三 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min，全部液体转移至1mL 玻璃比色皿 （光径1cm），700nm 下读取各管吸光值A， △A=A 测定-A 对照（每个样本做一个自身对照）。 | ||
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.6624x - 0.003，x 是标准品摩尔质量（μmol/mL）, y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：每小时每毫克组织蛋白分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mg prot)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2] ÷（V1×Cpr）÷T=12.08×(△A+0.003)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：每小时每克组织分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/g 鲜重)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(W× V1÷V)÷T=12.08×(△A+0.003)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：每小时每1 万个细菌或细胞分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h /104 cell)= [(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△A+0.003)
5、按液体体积计算:
定义：每小时每毫升液体分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mL)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷V1÷T=12.08×(△A+0.003)
V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.06mL ；
V2---酶促反应总体积，0.24mL； T---反应时间，1/2 小时；
W---样本鲜重，g； 500---细菌或细胞总数，500 万。Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。附：标准曲线制作过程：
1. 制备标准品母液（5μmol/mL）：标准品用10mL 试剂一溶解。（母液需在两天内用）。
2. 把母液稀释成六个浓度：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3. 依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
