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一、产品简介：
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH，EC 1.1.1.43）是磷酸戊糖途径中关键酶之一，在维 持细胞NADPH 水平上起重要作用，与生物体能量平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖酸和NADP+生成NADPH。进而与特异显色探针反应生成有色物质，通过检测该有色
物质的增加速率，计算出6-PGDH 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体25mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 |
粉剂mg×1 瓶 |
4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部（量少，勿损失），再加17.5mL 试剂一充分溶解， 用不完的试剂4℃保存。 |
试剂三 | 液体1mL×EP 管 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1 支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、和蒸馏水。
四、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGDH）活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1 的比例进行提
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度25℃,调节波长至450nm。
② 试剂解冻至室温（25℃）或于水浴锅（25℃）中孵育15-25min。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂二 | 170 |
试剂三 | 10 |
混匀，25℃条件下，立即于450nm 处读取A1 值，20min 后读取 A2 值，（观察：酶活性越大，则黄色越明显）。 ΔA=A2-A1。 | |
【注】：若ΔA 小于0.01，可以延长反应时间T（如由20min 延至60min 或更长）再读取A2；
或加大样本取样量W（如增加到0.2g）；或增加样本加样量V1（如由20μL 增至50μL，则试剂二相应减少），重新调整后的T 和W 和V1 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.0795x - 0.0107，x 是NADPH 摩尔质量（nmol）,y 是ΔA。2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 的NADPH 的酶量为1 个酶活单位。
6PGDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0107)÷0.0795]÷(Cpr×V1)÷T=31.45× (ΔA+0.0107)÷Cpr
3、按样本质量计算：
酶活定义：每克组织每分钟催化产生1nmol 的NADPH 的酶量为1 个酶活单位。
6PGDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0107)÷0.0795]÷(V1 ÷V×W)÷ T=31.45×(ΔA+0.0107)÷W
4、按细胞数量计算：
酶活定义：每百万细胞每分钟催化产生1nmol 的NADPH 的酶量为1 个酶活单位。
6PGDH(nmol/min/104cell)=[(ΔA+0.0107)÷0.0795]÷(V1÷V×500)÷T=31.45× (ΔA+0.0107)÷500
5、按液体体积计算：
酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生1nmol 的NADPH 的酶量为1 个酶活单位。
6PGDH(nmol/min/mL)=[(ΔA+0.0107)÷0.0795] ÷V1÷T =31.45×(ΔA+0.0107)
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02 mL；
W---样本质量，g； T---反应时间，20 min；500---细胞数量，万；
Cpr 样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（4nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5. nmol/μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 按照20μL 标准品+170μL 试剂一+10μL 试剂三，根据结果即可制作标准曲线。
