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一、产品简介：
6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH；EC 1.1.1.49）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是磷酸戊糖途径的关键酶，同时维持NADPH 在细胞内的水平，NADPH 反过来维持细胞中谷胱甘肽水平进而保护细胞免受氧化损伤。因此G6PDH 活性高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。
G6PDH 催化6-磷酸葡萄糖氧化为6 -磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP+还原为NADPH，传统方法是检测NADPH 在340nm 处的吸光值。由于NADPH 的摩尔消光系数（ε）较低，所以这种方法灵敏度低，且严重受到干扰。
本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：该酶促过程产生的NADPH 与特异显色剂反应产生在450nm 处有最大吸收峰的有色物质，通过检测450nm 处的增加速率，进而计算出G6PDH 酶活性大小。
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体50mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1 瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加38mL 试剂一充分溶解，用不完试剂4℃保存。 |
试剂三 | 液体1.1mL×2 支 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1 支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
三、所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰。
四、6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm 离心 10min，取上清作为待测样品。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，设置温度37℃，调节波长至450nm，蒸馏水调零。
② 试剂放在 37℃水浴5-15min；在1mL 玻璃比色皿中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 40 |
试剂二 | 720 |
试剂三 | 40 |
混匀，立即于 450nm 处读取 A1 值，于 37℃条件下，20min 后读取 A2 值，（观察：酶活性越大，则黄色越明显）， | |
【注】：若ΔA 过小，可以延长反应时间（如：60min 或更长）再读取A2，或加大样本取样量（如增加到0.2g），重新调整的反应时间T 需代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、标准曲线方程：y = 0.0321x + 0.0069，x 是NADPH 摩尔质量：nmol,y 是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：在37℃，每毫克组织蛋白每分钟使1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成1 nmol 6 -磷酸葡萄糖酸内酯并且使1 nmol NADP+转换成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。G6PDH(nmol/min/mg prot)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷ (V1 ×Cpr) ÷T=38.94×(ΔA-0.0069)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：在37℃，每克组织每分钟使1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成1 nmol 6 -磷酸葡萄糖酸内酯并且使1 nmol NADP+转换成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。G6PDH(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321 ]÷(W× V1÷V) ÷T=38.94×(ΔA-0.0069)÷W
4、按细胞数量计算：
单位定义:在37℃，每104 个细胞每分钟使1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成1 nmol 6 -磷酸葡萄糖酸内酯并且使1 nmol NADP+转换成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。G6PDH(nmol/min/104 cell)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321] ÷(500×V1÷V)÷T= 0.078×(ΔA-0.0069)
5、液体样本中G6PDH 活力计算：
单位的定义：在37℃，每毫升液体每分钟使1 nmol 6-磷酸葡萄糖氧化成1 nmol 6 -磷酸葡萄糖酸内酯并且使1 nmol NADP+转换成1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。G6PDH(nmol/min/mL)=[(ΔA-0.0069)÷0.0321]÷V1÷T=38.94×(ΔA-0.0069)
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04 mL； W---样本质量，g。
T---反应时间，20 min；若加大了反应时间，则重新调整的反应时间值要代入公式重新计算；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（4nmol/μL）：向标准品 EP 管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2 把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. nmol/μL。
3 依据40μL 标准品+720μL 试剂一+40μL 试剂三，混匀后室温5min 后于450nm 处读值，根据结果即可制作标准曲线。
