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一、产品简介：
海洋无脊椎动物主要存在4 种无氧代谢途径，其中葡萄糖-opine 途径在无氧代谢初期发挥了重要作用，无脊椎动物中特有的Opine 脱氢酶(OpDHs)保证了这一过程的顺利进行。Alanopine 脱氢酶(ADH；EC 1.5.1.17 )是Opine 脱氢酶(OpDHs)系列酶中的一种。
Alanopine 脱氢酶(ADH)催化丙酮酸和特异底物丙氨酸反应生成相应的亚氨基酸，同时使NADH 发生氧化，通过检测NADH 在特征吸收波长340nm 处的下降速率即可得出ADH 酶活性大小。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 |
粉剂mg×2 支 |
-20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每支分别加0.55mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反 复冻融，一周内用完。 |
试剂二 | 液体μL×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底部，再 加1.1mL 蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体16mL ×1 瓶 | 4℃保存 |
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
四、Alanopine 脱氢酶(ADH)活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积(mL)为500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至340nm。
② 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂一 | 10 |
试剂二 | 10 |
试剂三 | 160 |
【注】1.若10s 后反应体系未稳定可延长到1min 后再读取A1 值。
2. 若△A 的值小于0.005，可以适当延长反应时T（如由5min 增至10min）读取A2，或适当加大样本量V1（如增至40μL，则试剂三相应减少），则改变后的T 和V1 需代入计算公式重新计算。
3. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的样本），可以适当减少样本加样量V1（如减至
10μL，则试剂三相应增加），则改变后的V1 需代入计算公式重新计算。
4. 若ΔA 的值大于0.35 或A2 值低于0.35，则需减少反应时间T（如减至5min）读取A2，则改变后的反应时间T 需代入计算公式重新计算。
5. 若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmol NADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=643.1×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：
定义：每克组织在每分钟内氧化1nmol NADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
定义：每一万个细菌或细胞每分钟内氧化1nmol NADH 所需酶量定为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×ΔA÷W
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL；
V2---反应体系总体积，2×10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm；
ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； W---样本质量，g；
T---反应时间，5min； 500---细菌或细胞总数，万；Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
