一、产品简介：

海洋无脊椎动物主要存在4 种无氧代谢途径，其中葡萄糖-opine 途径在无氧代谢初期发挥了重要作用，无脊椎动物中特有的Opine 脱氢酶(OpDHs)保证了这一过程的顺利进行。Alanopine 脱氢酶(ADH；EC 1.5.1.17 )是Opine 脱氢酶(OpDHs)系列酶中的一种。

Alanopine 脱氢酶(ADH)催化丙酮酸和特异底物丙氨酸反应生成相应的亚氨基酸，同时使NADH 发生氧化，通过检测NADH 在特征吸收波长340nm 处的下降速率即可得出ADH 酶活性大小。

二、试剂盒的组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

四、Alanopine 脱氢酶(ADH)活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；12000rpm，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积(mL)为500~1000：1 的比例进行提取。

2、上机检测：

① 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

② 在 1mL 石英比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】1.若10s 后反应体系未稳定可延长到1min 后再读取A1 值。

2. 若△A 的值小于0.005，可以适当延长反应时T（如由5min 增至10min）读取A2，或适当加大样本量V1（如增至100μL，则试剂三相应减少），则改变后的T 和V1 需代入计算公式重新计算。

3. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的样本），可以适当减少样本加样量V1（如减至

30μL，则试剂三相应增加），则改变后的V1 需代入计算公式重新计算。

4. 若ΔA 的值大于0.35，则需减少反应时间T（如减至2min），则改变后的反应时间T 需代入计算公式重新计算。

5. 若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmol NADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。

ADH(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=375.13×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：

定义：每克组织在每分钟内氧化1nmol NADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。

ADH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=375.13×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

定义：每一万个细菌或细胞每分钟内氧化1nmol NADH 所需酶量定为一个酶活力单位。

ADH(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.75×ΔA÷W

V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.06mL；

V2---反应体系总体积，7×10-4 L； d---光径，1cm；ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； W---样本质量，g；

T---反应时间，5min； 500---细菌或细胞总数，万；Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。