一、产品简介：

3- 磷酸甘油酸激酶(PGK)是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化3- 磷酸甘油酸和ATP 反应产生1,3-二磷酸甘油酸，后者在3-磷酸甘油醛脱氢酶和NADH 作用下产生3-磷酸甘油醛和NAD+，通过测定NADH 的下降量，进而得到3-磷酸甘油酸激酶(PGK)的活性大小。

二、试剂盒的组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

酶标仪、96 孔板、可调式移液器、天平、震荡仪、低温离心机、研钵。

四、3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆后于4℃，12000rpm 离心5min，取上清液体待测。

【注】:若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；12000rpm 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】:若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1 的比例进行提取。

2、上机检测：

① 酶标仪预热 30min，调节波长至340nm，设定温度25℃。

② 所有试剂解冻至室温（25℃）。

③ 在 96 孔板中依次加入：

【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到20min 后读取A2，改变后的反应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(如40μL，则试剂四相应减少)，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。

2. 若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

3. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；

4. 若ΔA 的值大于0.5，则需减少反应时间（如减少至5min），或减少样本量（如10μL），则改变后的反应时间T 和样本量V1 需代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、按照样本质量计算：

酶活定义：每克组织每分消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GPK(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=321.6×ΔA÷W

2、按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每毫克组织蛋白每分钟内氧化1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GPK(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=321.6×ΔA÷Cpr 3、按细菌/细胞数量计算：

单位定义：每104 个细胞每分钟内氧化1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GPK(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.64×ΔA÷Cpr

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d---比色皿光径，0.5cm；

V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.02mL；

V2---反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L； T---反应时间，10min；

W---样本质量，g； 500---细胞数量，万；

Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白质含量测定试剂盒。