一、产品简介：

3- 磷酸甘油醛脱氢酶分为胞质型和质体型，细胞质中的3-磷酸甘油醛脱氢酶（EC

1.2.1.12）是糖酵解的中枢环节之一，特异的以NADH 为辅酶，催化3 磷酸甘油醛形成1,3 二磷酸甘油酸的可逆反应，与糖异生途径及体内血糖浓度的维持、糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

本试剂盒耦联3-磷酸甘油酸激酶，以三磷酸甘油酸为底物，于340nm 处测定NADH

的下降速率来得出NADH-GAPDH 酶活性的大小。

二、试剂盒的组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、可调式移液器、天平、震荡仪、低温离心机、研钵。

四、3-磷酸甘油醛脱氢酶(NADH-GAPDH)活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500 万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000:1 比例提取。

③ 液体样本（如血清）：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 紫外分光光度计预热 30min，调节波长至340nm，设定温度25℃，蒸馏水调零。

② 所有试剂解冻至室温（25℃）。

③ 在 1mL 石英比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】1.若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到20min 后读取A2，改变后的反应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量(如100μL，则试剂四相应减少)，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。

2. 若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

3. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；

4. 若ΔA 的值大于0.5，则需减少反应时间（如减少至5min），或减少样本量（如20μL），则改变后的反应时间T 和样本量V1 需代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、按照样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

NADH-GAPDH(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr)÷T=193×ΔA÷Cpr 2、按照样本质量计算：

酶活定义：每克组织每分消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

NADH-GAPDH(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=193×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

酶活定义：每一万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

NADH-GAPDH(nmol/min/104 cell)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(500×V1÷V)÷T=0.39×ΔA

4、按液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

NADH-GAPDH(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=193×ΔA

ε---NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L /mol/cm； d---比色皿光径，1cm；

V---加入提取液体积，1mL； V1---加入样本体积，0.06mL；V2---反应体系总体积，0.72mL=7.2×10-4L； T---反应时间，10min；

W---样本质量，g 500---细菌或细胞数量，万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。