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一、产品简介：
6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH，EC 1.1.1.200）又称醛糖6-磷酸还原酶（Aldose-6-phos
-phate reductase，A6PR），催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和D-葡萄糖 6-磷酸之间的相互转化。研究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布，其在山梨醇合成中起着重要作用。
6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）催化D-葡萄糖6-磷酸还原，并使还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化。因此，通过检测340nm 下NADPH 的下降速率，即可得出S6PDH 的酶活性大小。
该酶催化的反应：D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H+
二、试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 |
粉剂mg×2 支 |
4℃保存 |
用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每支分别加0.4mL 蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂二 | 液体10mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 0.6mL 蒸馏水溶解备用。 |
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。
四、6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 液体样本：澄清的液体样本，可直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至340nm。
② 所有试剂解冻至室温（25℃），或可于水浴锅（25℃）中孵育 15-25min。
③ 试剂一和二可按照 10:160 比例配成混合液（一枪加170μL 该混合液）（该混合液用多少配多少，现配现用）；在 96 孔板中依次加入：
【注】1.若10s 后反应体系未稳定可延长到1min 再读值。
2.若△A 小于0.01，可适当延长反应时间T 至20min 或更长读取A2，或适当加大样本量V1
（如增至40μL，则试剂二相应减少），则改变后的T 和V1 需代入计算公式重新计算。
4. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量V1，则改变后的V1 需代入计算公式重新计算。
或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；
5. 若ΔA 大于0.25，需减少反应时间T（如减至5min），则改变后的T 需代入公式重新计算。
6. 若下降趋势不稳定，可以每隔30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。
五、结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(V1×Cpr) ÷T=321.5 ×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：
单位定义：每克组织在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T= 321.5×ΔA÷W
3、按液体体积计算：
单位定义：每毫升液体在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1÷T= 321.5×ΔA
V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.02mL；
V2---反应体系总体积，2×10 -4 L； d---96 孔板光径，0.5cm；
ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 3 L/mol/cm； W---样本质量，g；T---反应时间，10min；
Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
