一、产品简介：

6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH，EC 1.1.1.200）又称醛糖6-磷酸还原酶（Aldose-6-phos

-phate reductase，A6PR），催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和D-葡萄糖 6-磷酸之间的相互转化。研究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布，其在山梨醇合成中起着重要作用。

6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）催化D-葡萄糖6-磷酸还原，并使还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化。因此，通过检测340nm 下NADPH 的下降速率，即可得出S6PDH 的酶活性大小。

该酶催化的反应：D-sorbitol 6-phosphate+NADP⁺=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H⁺

二、试剂盒组成和配制：

三、所需的仪器和用品：

紫外分光光度计、1mL 石英比色皿（光径 1cm）、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰。

四、6-磷酸山梨醇脱氢酶（S6PDH）活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品和实验流程，避免样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：称取约 0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。

② 液体样本：澄清的液体样本，可直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

① 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

② 所有试剂解冻至室温（25℃），或可于水浴锅（25℃）中孵育 15-25min。

③ 试剂一和二可按照 20:680 比例配成混合液（一枪加700μL 该混合液）（该混合液用多少配多少，现配现用）；在 1mL 石英比色皿（光径 1cm）中依次加入：

【注】1.若10s 后反应体系未稳定可延长到1min 再读值。

2.若△A 小于0.01，可适当延长反应时间T 至20min 或更长读取A2，或适当加大样本量V1

（如增至60μL，则试剂二相应减少），则改变后的T 和V1 需代入计算公式重新计算。

4. 若起始值A1 太大如超过2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量V1，则改变后的V1 需代入计算公式重新计算。

或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；

5. 若ΔA 大于0.3，需减少反应时间T（如减至5min），则改变后的T 需代入公式重新计算。

6. 若下降趋势不稳定，可以每隔30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的A 值也代入计算公式重新计算。

五、结果计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(V1×Cpr) ÷T=305.5×ΔA÷Cpr 2、按样本鲜重计算：

单位定义：每克组织在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

S6PDH 活力(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=305.5×ΔA÷W

3、按液体体积计算：

单位定义：每毫升液体在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

S6PDH 活力(nmol/min/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷V1÷T=305.5×ΔA÷W

V---加入提取液体积，1 mL； V1---加入样本体积，0.04mL；

V2---反应体系总体积，7.6×10 ^-4 L； d---光径，1cm；

ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×10 ³ L /mol/cm； W---样本质量，g；T---反应时间，10min；

Cpr---蛋白浓度（mg/mL），建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。