苏州艾莱萨生物科技有限公司

一、产品简介：

ADPG 焦磷酸化酶(AGP，EC 2.7.7.27)是植物淀粉合成过程中起关键性调节作用的酶，催化l-磷酸葡萄糖(G-1-P)与三磷酸腺苷(ATP)反应形成淀粉合成的直接前体腺苷二磷酸葡萄糖(ADPG)，在植物中，主要存在于贮藏器官和叶片中。

AGP 催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm 下测定NADPH 增加速率，即可计算AGP 活性。

二、测试盒组成和配制：

【注】：粉剂量在mg 级别，使用前用手甩几次或者进行离心，打开直接加入要求的试剂即可。

三、所需的仪器和用品：

可见分光光度计、1ml 石英比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

四、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、样本制备：

① 组织样本：

称取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.2g），加 1mL 提取液，进行冰浴匀浆，

12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

【注意】若样本颜色较深（如较深颜色的植物叶片），可引起起始值A1 值较大如超过1.5，可在样本制备过程中增加除色素步骤：取约0.1g 组织（水分充足的样本可取0.5g），加入1mL 的80%乙醇冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，弃掉色素较深的上清液；以上除色素步骤重复2 次。最后向离心得到的沉淀中加入1mL 提取液，混匀或再次冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测

② 液体样品：澄清的液体样本直接检测；若浑浊则离心后取上清液检测。

2、上机检测：

① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至340nm，设定温度为30℃，蒸馏水调零。

② 所有试剂解冻至室温（25℃），或可放在 25℃条件下水浴 15min 左右。

③ 试剂一和二和三可按照 20:20:540 比例配成混合液（一枪加580μL 该混合液）（该混合液用多少配多少，现配现用）。

④ 在 1mL 石英比色皿（光径1cm）中依次加入：

【注】1. 若ΔA 在零附近徘徊，可延长反应时间T 至60min 后或更长读取A2；或加大样本上样量V1（如增至200μL，则试剂三相应减少，保持总体积不变）；或增加样本取样质量W；则改变后的T 和V1 以及W 需代入计算公式重新计算；

2. 若上升趋势不稳定，可以每隔10S 读取一次吸光值，选取一段线性上升的时间段来参与计算，相对应的A1 和A2 值也代入计算公式重新计算。

3. 若△A 的值大于0.4，需缩减反应时间T（如减至10min 或更短），或减少样本上样量V1

（如减至50μL，则试剂三相应增加，保持总体积不变）；则改变后反应时间T 和V1 需代入公式重新计算。

五、结果计算：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(V1×Cpr) ÷T=38.6×ΔA÷Cpr 2、按照样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织每分钟催化产生1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷(W×V1÷V)÷T=38.6×ΔA÷W

3、按照液体体积计算：

酶活定义：每毫升液体每分钟催化产生1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2×109]÷V1÷T=38.6×ΔA

ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L /mol/cm； V---加入提取液体积，1mL；

V1---加入样本体积，0.1mL； V2---反应体系总体积，7.2×10-4 L；

d---比色皿光径，1cm； T---反应时间，30min；W---样本质量，g ；

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA 蛋白含量检测试剂盒。