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一、产品简介：
ABTS 是一种介体物质，用K2S2O8 与ABTS 直接生成稳定的阳离子自由基ABTS+，抗氧化物质与ABTS+发生反应而使反应体系褪色。
ABTS+·自由基离子的最大吸收波长为734nm，所以，用A734 nm 可以检测ABTS+·自基离子的浓度。如果A734nm 减小，表明ABTS+·自由基离子被清除，进而对样本中ABTS 清除能力进行定量分析。
二、试剂盒的组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 粉剂mg×2 支 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部，每支加 0.49mL 蒸馏水溶解（溶解后一周内用完）。 |
试剂二 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 2.86mL 蒸馏水，充分溶解备用。 |
标准品 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 |
若重新做标曲，则用到该试剂。 |
工作液配置：临用前将加水溶解后的试剂一和试剂二按照1:1 比例混合，避光反应12h 后（二天内用完），再用无水乙醇稀释20-30 倍备用（使A 空白管在0.7±0.1，用乙醇稀释后的液体即工作液最好现配现用）。
三、所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、甲醇、无水乙醇和蒸馏水。
四、ABTS 自由基清除能力测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：
称取约0.1g 新鲜组织或者称取约0.05g 烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过 40 目筛，得到烘干样本），加入 1mL 的 80%甲醇提取液（若鲜样需研磨均质），于 60℃，200-300W 条件下超声提取 30min（间隔 5min 振荡混匀一次），若有损失需用 80%甲醇定容至 1mL。12000rpm 室温离心 10min，取上清测定。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：
先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细菌或细胞加入1mL 的80% 甲醇提取液进行匀浆；匀浆后转入2mL 离心管中；于60℃，200-300W 条件下超声提取30min（间隔5min 振荡混匀一次），若有损失需用80%甲醇定容至1mL。12000rpm，离心10min，取上清置冰上待测。
【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104 个）：提取液（mL）为1000~5000: 1 比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至734nm。
② 不同样本清除能力不一，可先选取2 个样本做检测，若A 测定-A 对照接近零，需对样本进行稀释（用80%甲醇提取液稀释）后再检测，稀释倍数D 代入公式计算。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称（μL） | 测定管 | 对照管 | 空白管（仅做一次） | ||
样本 | 10 | 10 | |||
无水乙醇 | 190 | 10 | |||
工作液 | 190 | 190 | |||
混匀，室温（25℃）避光静置6min，于734nm 处读取吸光值A。 | |||||
【注】若一次性样本较多，可用排枪或者分批检测，以使测定管的反应时间（避光静置6min）保持一致。
五、结果计算：
1、标准曲线：y = 0.5042x - 1.4213，x 是标准品 Trolox 质量（μg/mL），y 是清除率（%）。2、ABTS 自由基清除率(%)=[(1-(A 测定-A 对照)÷A 空白)×100]%
3、定义：用从标准曲线上获得的抗氧化剂Trolox的量来表示样本的ABTS自由基清除能力。
4、按样本质量计算：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/g 鲜重)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D
=1.983×(清除率+1.4213)÷W×D
举例：若清除率是70%，则用70 代入公式计算，即：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/g 鲜重)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×W)×D 5、按细菌或细胞数量计算：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(清除率+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D
=1.983×(清除率+1.4213)÷500×D
举例：若清除率是70%，则用70 代入公式计算，即：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/104 cell)=[(70+1.4213)÷0.5042×V1]÷(V1÷V×500)×D
6、液体样本：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(清除率+1.4213)÷0.5042]×D
=1.983×(清除率+1.4213)×D
举例：若清除率是70%，则用70 代入公式计算，即：
ABTS 自由基清除能力(μg Trolox/mL)=[(70+1.4213)÷0.5042]×D
V---加入提取液体积，1 mL； V1---反应中样品体积，10μL=0.01 mL；W---样品质量，g； 500---细菌或细胞总数，万；
Trolox 分子量---250.29； D---稀释倍数，未稀释即为 1；附：标准曲线制作过程：
1 制备标准品母液（1mg/mL）：称取 2mg 标准品即 Trolox 至一新 EP 管，再加 2mL 甲醇充分溶解，即1mg/mL 标准品，备用。
2 把母液用甲醇稀释成以下浓度梯度的标准品：0，20，40，60，80，100μg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3 按照测定管加样体系操作，依据结果即可制作标准曲线。
